研究摘要：
细胞因子诱导的记忆样( ML ) NK细胞经IL-12、IL-15和IL-18激活后分化，表现出强大的抗肿瘤作用，并安全地完全缓解白血病患者的症状。然而，多种癌症通过NK细胞受体并不能被完全识别，嵌合抗原受体( CAR )已被效应淋巴细胞用于增强肿瘤特异性识别。为了验证记忆样NK细胞分化及CAR修饰可引起对NK耐受癌症的协同反应，本研究将外周血ML-NK细胞修饰表达抗CD19 CAR (19-CAR-ML )，与非特异性CAR – ML-NK细胞或传统CAR-NK细胞相比，其IFN-γ的产生、脱粒以及对NK耐受淋巴瘤细胞株和主要靶细胞的特异性杀伤均显著加强。结果显示19-CAR与ML能产生协同反应并具有CAR特异性及依赖ITAM信号的特点，19-CAR-ML-NK细胞能在人异种移植模型体内控制淋巴瘤负荷，并提高存活率。此外，淋巴瘤患者产生的19-CAR-ML-NK对自体淋巴瘤的症状也有所改善。结果表明，CAR修饰的ML-NK细胞增强了对多种NK细胞耐受肿瘤的识别与抗肿瘤作用，值得进一步深入研究。
一.CAR慢病毒载体有效转导人外周血ML-NK细胞
本研究用scFv靶向CD-19构建了含有CD137 和CD3ζ作为胞内信号结构域的第二代嵌合抗原受体(19-CAR)(图1A)，和缺乏ITAM信号结构域的19-CAR分子（19-CARtrunc）。CD137 和CD3ζ可被内源性NK细胞用于信号传导与激活，CAR结构中P2A-GFP的表达用于测量NK细胞的CAR表达水平。纯化的外周血NK细胞用IL-12/15/18刺激可获得ML-NK细胞，或用IL-15激活可获得对照NK细胞(cNK)(图1B)。用慢病毒转导后，培养5-7天使得ML-NK细胞进行分化及CAR进行表达，此方法对于ML-NK和cNK细胞的转导效率并没有显著性差异，但ML-NK有更高转导效率的趋势(图1C)。另外，用可溶性CD19分子给19-CAR-ML-NK细胞染色，结果显示抗CD19-CAR的表达与GFP的表达具有一致性(图1D)。
二.质谱流式细胞术显示了记忆样NK细胞无偏倚的慢病毒转导
本研究采用基于t-SNE聚类的质谱流式细胞技术对分选的GFP阴性( CAR- )和GFP阳性( CAR + ) 19-CAR-ML-NK细胞进行评估。在viSNE图中cNK细胞的位置与ML-NK及CAR-ML-NK细胞有明显区别(图1E-F)。相反，ML-NK和CAR-ML-NK细胞在viSNE图中有重叠，并且评估标志物具有很高的表达一致性(图1E-G)。激活性受体、抑制性受体或成熟阶段亚群也无明显偏倚，结果表明CAR转导的ML-NK细胞与非CAR转导的ML-NK细胞共享抗体文库及亚群多样性(图1G)。
三.与CAR-cNK细胞相比，CAR-ML -NK细胞表现出增强的功能反应
为了解ML分化及CAR表达是如何促进抗淋巴瘤反应的，本研究将同一供体的19-CAR-ML-NK细胞与19-CAR-cNK 细胞对Raji靶细胞进行了比较评估(图2A-B)。与cNK细胞(19-CAR-)相比，19-CAR-cNK细胞显著增加了针对Raji靶细胞的IFN-γ和脱粒的产生量(图2B-D)。与cNK细胞相比(19-CAR-)，ML-NK(19-CAR-)细胞显著增强IFN-γ针对Raji靶细胞的反应，与其他上述细胞相比，19-CAR-ML-NK 细胞表现出优异的IFN-γ和脱粒反应(图2B-D)。本研究通过结合指数(CI)来评价ML分化与CAR表达针对Raji靶细胞的协同作用，结果表明CAR和ML分化可增强NK细胞功能(图2E)。另一细胞杀伤实验显示，与19-CAR-cNK细胞相比，19-CAR-ML-NK细胞表现出更强的对Raji靶细胞杀伤作用(图2F)。因此，记忆样分化和CAR修饰结合起来，可以最大程度地发挥19-CAR-ML-NK细胞的抗淋巴瘤效应功能和对CD19+靶细胞的细胞毒作用。
图2：与CAR-cNK细胞相比，CAR-ML-NK细胞表现出增强的功能反应
四.19-CAR-ML-NK细胞对需要CAR信号的CD19+靶细胞表现出CD19特异性反应
CD19+Raji靶点与CD19- Kasumi-3(Kas-3)靶点被用于19-CAR-ML-NK细胞对CD19抗原特异性的研究。结果显示，与ML-NK细胞相比，19-CAR-ML-NK细胞针对Raji靶点，IFN-γ产生量增加了4倍，脱粒产生量增加了6倍，但对Kas-3靶点的脱粒量变化很小(图3A-B)。与未转导的ML-NK细胞相比，对照CD33(33-CAR-ML)慢病毒转导的ML-NK细胞对Raji靶点(CD19+CD33-)的反应并没有增强，证实了19-CAR-ML-NK细胞对CD19抗原特异性(图3C-D)。此外，与33-CAR-ML-NK细胞对照组相比，19-CAR-ML-NK细胞对Raji靶细胞杀伤率增加(图3E)。为了确定是否需要CAR细胞内信号组分来增强抗肿瘤反应，用Raji靶点刺激19-CARtrunc-ML可以消除在19-CAR-ML-NK细胞中观察到的IFN-γ产生和脱粒的增加效应(图3F-G)。综上所述，研究表明19-CAR-ML-NK细胞的增强反应是具有CAR抗原特异性的，并且需要细胞内的CAR ITAM信号。
图3：19-CAR-ML-NK细胞对肿瘤细胞系表现出增强的抗原(CD19)特异性反应
五.19-CAR-ML-NK细胞对患者原发性淋巴瘤细胞的反应增强
在19-CAR-ML-NK细胞对CD19+原发性淋巴瘤的体外抗肿瘤活性研究中，与19-CAR-cNK细胞相比，19-CAR-ML-NK细胞对原发性患者淋巴瘤细胞的IFN-γ的产生和脱粒显著增加(图4A)。19-CAR-ML-NK细胞对原发性淋巴瘤靶点的增强反应是CAR抗原特异性的，而在33-CAR-ML-NK细胞中没有观察到(图4B)。19-CAR-ML-NK细胞和33-CAR-ML-NK细胞对原发性淋巴瘤靶点的细胞毒性的测试结果显示，与33-CAR-ML-NK细胞相比，19-CAR-ML-NK细胞的杀伤能力显著提高(图4C)。因此，19-CAR-ML-NK细胞增强了对原发性淋巴瘤靶点的CAR-抗原特异性抗肿瘤反应。
六.淋巴瘤患者19-CAR-ML-NK细胞对自体淋巴瘤细胞的反应
为了探究淋巴瘤患者的NK细胞可否被修饰并对其自身的淋巴瘤细胞产生反应，通过对淋巴瘤患者中生成的19-CAR-ML-NK细胞的收集并对其功能反应进行检测(图4D)，结果显示，ML-NK细胞对自体淋巴瘤靶细胞的反应较弱(图4E-H)，而19-CAR-ML-NK产生了显著增加了IFN-γ和脱颗粒的产生。研究表明，在患者ML-NK细胞中添加靶向CAR分子可显著提升自体抗肿瘤NK反应。
图4：19-CAR-ML-NK细胞对体外原发性淋巴瘤靶细胞的反应增强
七.19-CAR-MLNK细胞在体内具有:CAR抗原特异性扩增
将Raji细胞植入NSG小鼠并进行19-CAR-ML和33-CAR-ML-NK细胞过继，建立Raji细胞的荷瘤小鼠模型(图5A)。NK细胞转移后第18天，在Raji存在的情况下，与33-CAR-ML受体小鼠相比，19-CAR-ML-NK细胞占体内NK细胞数量的40-90%，数量显著增加(图5B-D)。研究表明，CAR介导的CD137/CD3z信号有助于体内存在CD19表达靶点时，NK细胞的存活和扩增。
图5：19-CAR-ML-NK细胞在体内具有持续的抗原特异性
八.19-CAR-ML-NK细胞在体内对淋巴瘤靶细胞的抑制
为检测CAR表达对体内ML-NK细胞效应功能的影响，向NSG小鼠静脉注射表达荧光素酶的Raji细胞，并单次注射1.9 × 105个19-CAR-ML-NK细胞或33-CAR-ML NK细胞(总NK细胞量为3-5 × 106个)(图6A)，过继转移后，给予低剂量rhIL-15以维持体内NK存活。采用生物发光成像(BLI)监测肿瘤负荷。与未治疗的荷瘤小鼠和33-CAR-ML-NK细胞治疗的小鼠相比，使用19-CAR-ML-NK细胞治疗的小鼠肿瘤负荷显著降低(图6B-D)。与33-CAR-ML-NK细胞相比，单次注射19-CAR-ML-NK细胞后，提高了治疗小鼠的生存率(图6E)。实验结果表明，19-CAR-ML NK细胞在体内增强了对肿瘤生长的抑制。
图6：19-CAR-ML NK细胞能有效抑制NSG小鼠体内淋巴瘤细胞
本研究从外周血NK细胞中构建了稳定的CAR-ML-NK细胞并通过ML分化和CAR介导产生显著协同作用，诱导了对NK耐受肿瘤的有效反应。实验证实，增强的CAR-ML-NK细胞功能反应(细胞毒性、脱颗粒和细胞因子的产生)具有CAR抗原特异性的，并且需要CAR信号传导。由淋巴瘤患者NK细胞生成的19-CAR-ML-NK细胞提高了对自体淋巴瘤靶点的抗肿瘤反应。此外，19-CAR-ML-NK细胞能够在小鼠移植瘤模型中有效扩增和持续地控制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的存活。
本研究证明了从供体和患者外周血中生成CAR修饰的ML-NK细胞的可行性和原理证明。CAR-ML-NK细胞拓展了抗肿瘤识别谱，并在体内外表现出特异性和有效的抗肿瘤反应。CAR-ML-NK细胞也有可能通过不同的CAR特异性来识别血液系统恶性肿瘤，极大地扩大了外周血NK细胞的抗肿瘤库。因此，CAR-ML-NK细胞术的发展为CAR修饰的NK细胞免疫治疗提供了一种新的方法，并值得进一步进行临床前和临床研究。
参考文献：Gang M, Marin ND, Wong P, Neal CC, Marsala L, Foster M, Schappe T, Meng W, Tran J, Schaettler M, Davila M, Gao F, Cashen AF, Bartlett NL, Mehta-Shah N, Kahl BS, Kim MY, Cooper ML, DiPersio JF, Berrien-Elliott MM, Fehniger TA. CAR-modified memory-like NK cells exhibit potent responses to NK-resistant lymphomas. Blood. 2020 Nov 12;136(20):2308-2318. doi: 10.1182/blood.2020006619. PMID: 32614951; PMCID: PMC7702478.
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