来源：华人抗体
近日，华人抗体协会旗下期刊、牛津大学出版社出版的Antibody Therapeutics发表了新加坡A∗STAR研究院 Samuel Ken-En Gan教授课题组关于抗体人源化需要考虑的要素和各要素作用的综述，原文标题为‘Sagacity in antibody humanization for therapeutics, diagnostics and research purposes: considerations of antibody elements and their roles’。随着抗体药物在治疗自身免疫病、癌症等方面的突破，治疗性抗体的市场正稳步快速的增长。然而，基于单克隆抗体的药物发过程仍然很昂贵，且候选药物可能会因临床试验中的不良反应，比如强免疫原性引起的过敏反应而失败。尽管在药物开发的早期阶段通常很难预测到这一点，但随着对抗体功能和活性的深入了解，通过合理设计可以在抗体人源化步骤中减轻或避免此类不良反应。在这篇综述中，作者讨论了关于抗体各个要素的最新发现，即重链和轻链的可变（V-）和恒定（C-）区域，以及它们在抗体人源化过程中的作用，以及如何利用它们来研发更好用于治疗、诊断和研究的抗体。
该论文的英文全文可通过如下链接来免费获得：
https://academic.oup.com/abt/article/3/2/71/5822069
治疗性抗体的人源化步骤是决定抗体药物开发成功与否的关键。然而当前人源化的过程由于缺乏系统的科学理论指导，导致不同实验室采用截然不同的方法。资金雄厚的实验室可以使用自动化的高通量筛选方法，通过使用昂贵的仪器设备来获得最佳的人源化抗体。通常在这些高通量过程中，也仅仅分析标准关键参数，例如抗体产量，亲和力和是否聚集沉淀等。由于缺乏合适的临床前动物模型，只能在临床试验中，根据FDA指南，来检测治疗性抗体是否引起免疫原性和过敏性等不良反应。尽管可以通过附加的脱敏方案来缓解某些不良反应，但此类不良反应可以在人源化步骤中提前防止。因此，抗体人源化，需要更好的抗体定位，避免与超抗原的非特异性结合以及定制抗体依赖性触发的免疫应答，抗体对细胞的持久性等要素的考量都可以通过整体明智的方法优先权衡，从而获得更好的治疗效果。
图1. 可以被人源化的抗体元素示意图。左上方代表可变轻链（VL，红色），由Vκ1-6和Vλ1-111族组成。右上角代表可变重链（VH，黄色），由VH1–7族组成。右下角代表由γ1-4，α1-2，μ，δ，ε组成的恒定重链（CH，浅灰色）。左下角代表恒定的轻链（CL，深灰色），由Cκ和Cλ1-3、6-7组成。
早期的抗体人源化是通过鼠源抗体抗原结合区（antigen binding region）和人源IgG Fc形成嵌合体来减少免疫原性，以提高治疗安全性。现在随着对Fc工程化深入了解，通过对抗体恒定区改造来更有效提高治疗功能。因此，作者在这篇综述里强调了人抗体各种亚型以及如何在人源化过程中有效利用起来（图1）。
IgG是血液中含量最高的免疫球蛋白，达到73%。IgG 主要分为4种亚型：IgG1, IgG2, IgG3 和IgG4，其比例分别是60%，32%，4% 和4%。每个亚型高度相似但又有独自功能。目前FDA已经批准的治疗性抗体主要以亚型IgG1为主。IgG1 主要有ADCC （activate antibody dependent cellular cytotoxicity）, CDC(complement dependent cytotoxicity) 功能，且其有长半衰期（33.2天）。IgG2由于其ADCC和CDC功能较弱，因此很少用于作为治疗性抗体。但也有IgG2治疗性抗体存在，主要是用于阻断配体和受体之间的相互作用。IgG3是所有IgG 亚型中半衰期最短的（25.9天）。IgG3也是具有强的ADCC和CDC功能。由于其有长的铰链区（hinge）, 因此其分子量最大。另外IgG3是唯一IgG含有O-link 糖基化位点。IgG4和IgG2有点类似，其ADCC和CDC都较弱。IgG4独特之处在于会与其它的IgG4互换半边轻重链，从而影响其识别抗原。当然可以通过在IgG4 CH1区进行突变而阻止IgG4轻重链互换。IgG4通常用于构建双特异性抗体中功能性单价。在这些IgG不同亚型中，它们在瞬时转染表达重组蛋白量上没有明显差异，且对抗原结合亲和力也没有差异。这些IgG 亚型不同功能特征能够根据不同目的而选择不同亚型，例如需要强ADCC活性或者不需要ADCC活性。同时作者也在文中讨论了IgM, IgE, IgA1,2 a和IgD功能特性。
虽然很多抗体功能和作用主要来自于重链恒定区（CH），但是轻链恒定区（CL）也能影响到抗体整体上稳定性。在人源抗体中，CL包括两个亚型，kappa （Cκ）和lambda（Cλ）。Cλ还包括5种已知功能性亚型，Cλ1-3 和Cλ6-7（Cλ4-5归类为假基因）。在人类中Cκ 和Cλ比率接近于1：1，然而在鼠源中Cκ 和Cλ比率为20：1。因此在FDA已经批准的50多种人源化单克隆抗体中，大部分是采用kappa轻链，只有6种采用lambda轻链（Avelumab, Belimumab, Evolocumab, Raxibacumab, Guselkumab 和 Erenumab）。另外Cκ 和Cλ在重组蛋白产量上没有明显差异。一般而言，lambda轻链是和域间作用稳定性，长疏水CDR3区和短半衰期相关。所以作为治疗性抗体，lambda轻链需要在和重链强烈结合才有稳定性或者在体内需要快速清除抗体时可以考虑采用。
人源抗体包括三个不同可变区，即重链可变区（VH）1-7， lambda轻链（Vλ）1-11 和kappa轻链（Vκ）1-7。在人源化抗体整个过程中，动物源抗体CDRs序列被移植到人源抗体框架上。抗体可变区的框架区域（FWRs）通常认为是作为CDRs主要支撑区，也影响到形成抗体决定簇和抗原表位结合。虽然之前认为FWRs在和抗原识别上作用上很小，但最近的研究发现FWRs 也起着重要作用，能引起loop结构改变，VH 和 VL相互作用能影响CDRs方向，对超级抗原 protein L结合，Fc 受体（FcR）构象变化以及抗体的产量。
在可变区中，是否能准确区分开CDRs和FWRs 还是存在很多争议。由于CDRs有不同长度，一般倾向于把可变区分成六个界线：FWR1-CDR1-FWR2-CDR2-FWR3-CDR3-FWR4. 重链和轻链可变区通常从FWR1开始，但差别在于轻链可变区，有的实验室认为末端就只有CDR3区而没有FWR4, 因为轻链在V(D)J基因重排时缺少了diversity（D）基因。这些差异导致了各个实验室之间没有统一标准的CDR移植方法，而使人源化抗体有不同结果。
· FWRs 和CDRs
目前有六个不同系统平台（Kabat, Chothia, Martin, Gelfand, IMGT和Honneger）来预测FWR-CDR之间界线，这些系统各有优缺点。每一个系统都有它们独自的预测，但各个系统之间缺乏交叉验证。单纯依靠这些方法可能不能成功有效移植CDRs, 还需要序列结构上进行比对来额外检测。实际上，准确建立人工CDR/FWR界线和分析是非常有挑战性的，往往很多CDR移植序列还需要进行复原突变（back-mutations）以恢复原抗体亲和力。虽然FWRs参与一定程度上抗原结合，但还是以CDRs起着最主要抗原识别结合作用，因为单独移植CDRs序列就具有抗原结合特性。不同CDRs有着不同结合抗原比重（最高比重是VH CDR3）。往往CDRs序列细微改变就能明显影响抗原识别。而人源化抗体难度在于在判断CDR-FWR区域时只能每次根据一条链进行分析，而忽略了重链和轻链之间的联合。另外CDRs高度可变性和不同长度使人源化过程更加复杂。因此需要从六个CDRs(重链和轻链各3个) 进行深度分析，找出抗体决定簇特异序列 SDRs (specificity determining residues). 尽管有人尝试从CDRs中找出SDRs以减少免疫原性，但这种方法还是很少有人采用。目前CDRs移植仍然是最常见的人源抗体方法。
作者还在文章中列举了抗体人源化后需要考虑以下三个因素：产量，聚集和亲和力。失败的人源化抗体将会导致抗体产量很低或者失去原有抗原结合活性。甚至轻链FWR上一个‘非重要’氨基酸缺失都可能会明显影响到抗体表达。所以抗体的重链和轻链之间正确配对非常关键。人源化抗体引起的抗体聚集沉淀反应（aggregation）通常会增加治疗性抗体的免疫原性，因此需要结合不同的方法来控制影响聚集的外部和内部因子，以减少免疫原性。人源化抗体在CDR移植后需要能保持和原抗体对抗原一致的结合亲和力，且最近研究发现CDRs 和FWRs 也能影响到FcR结合（图2）。因此人源化抗体后要综合平衡各方面因素，包括抗体定位，产量，聚集反应和半衰期等等。
图2. CDRs/FWRs 和Fc受体结合区之间引起的抗体构象变化示意图
中文译者：陈梓榕 董永利
中文审阅：王守业
中文编辑：张琳
